Das Stadt- und Wallfahrtsmuseum zeigt im ersten Obergeschoss seine Bestände zur Wallfahrtsgeschichte, die vom 15. Jahrhundert bis in die Gegenwart reichen. Die Wallfahrt zum Heiligen Blut begann 1408 in Walldürn und wurde 1445 durch die Bulle Papst Eugens IV. bestätigt. Zu den Exponaten gehören Vortragstafeln von Prozessionen, Andachtsbilder, Darstellungen mit dem Heilig-Blut-Motiv, Votivgaben aus Wachs, Ton, Zinn und Silber neben anderen Gegenständen der Volksfrömmigkeit. Die Kunstsammlung umfasst Reliquiare, Andachtsliteratur aus dem ehemaligen Kapuzinerkloster in Walldürn sowie sakrale Gegenstände aus der Walldürner Wallfahrtskirche. Einen weiteren Schwerpunkt bildet der stadtgeschichtliche Bestand mit Archivalien, handwerklichem Gerät, Zeugnissen zur bäuerlichen und bürgerlichen Wohnkultur sowie Gemälden unter anderem von Michael und Sebastian Eckhardt. Die Römerabteilung zeigt Funde aus dem Walldürner Kastell und Bad, das zum UNESCO-Welterbe Obergermanisch-Raetischer Limes gehört.